SH590W-100 亮氨酸氨基肽酶（LAP）活性检测试剂盒 微量法 100管/96样
- 规格
规格：100T/96S
检测方法:微量法
英文名称:Leucine aminopeptidase (LAP) activity assay kit
储存条件:2-8℃
亮氨酸氨基肽酶（LAP）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前务必取2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：SH590W
规格：100T/96S
有效期：至少6个月。
产品内容：
试剂一：液体120mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存；临用前加入2.5mL丙酮溶解。
产品说明：
LAP是一种膜结合酶，广泛存在于肝、胆、胰等组织中，参与组织蛋白和某些肽类的降解更新。各类肝病患者因肝细胞损伤，血清LAP的活性均有不同程度的升高，LAP可以作为各类肝病的一项初步检测指标，特别是肝癌鉴别诊断的指标。
LAP分解L-亮氨酸对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在405nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算LAP活性。
试验中所需的仪器和试剂：
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、丙酮、匀浆器/研钵。
操作步骤：
一、样本处理：
组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 试剂一）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心10min。
细胞：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3 秒，间隔7 秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
液体：直接检测。
二、测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，波长调至405nm，分光光度计蒸馏水调零。
2. 加样表：在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入下列试剂
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试剂名称（ μL） |
测定管 |
空白管 |
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试剂一 |
10 |
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样品上清 |
10 |
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试剂一（ μL） |
170 |
170 |
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试剂二（ μL） |
20 |
20 |
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在微量玻璃比色皿 /96孔板中分别加入上述试剂，充分混匀后于 405nm处测定 30s时的吸光值A1，迅速置于 37℃水浴 3min（有控温功能的酶标仪可以将温度调至 37℃），拿出迅速擦干测定 210s时的吸光值 A2，计算 △ A空白管 =A2空白 -A1空白， △ A=△A测定管 -△A空白管。空白管只需做一次。 |
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三、酶活计算公式：
1、按微量玻璃比色皿计算：
（1）血清（浆）LAP 活力的计算：
单位的定义：每mL血清（浆）每分钟生成1nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（U/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109 ]÷V样÷T=675.4×ΔA
（2） 组织、细菌或细胞中LAP 活力的计算:
1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（U/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109 ]÷(V样×Cpr) ÷T=675.4×ΔA÷Cpr
2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（U /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109 ]÷(W× V样÷V样总) ÷T=675.4×ΔA÷W
3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（U /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109 ]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.35×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.87×103 L / mol /cm；109：
1mol=109nmol ；d：比色皿光径，25px；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入试剂一体积，1mL；T：反应时间，3 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
2、按96孔板计算：将上述计算公式中的d-25px 改为d-15px（96孔板光径）进行计算即可。
注意事项：
1、△A大于0.5时或者A值大于1.5时建议将样品上清用试剂一稀释后再进行测定。
2、空白管的△A变化小于0.01。
