亮氨酸氨基肽酶(LAP)活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:正式测定之前务必取2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号:SH590W
规格:100T/96S
有效期:至少6个月。
产品内容:
试剂一:液体120mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶,4℃避光保存;临用前加入2.5mL丙酮溶解。
产品说明:
LAP是一种膜结合酶,广泛存在于肝、胆、胰等组织中,参与组织蛋白和某些肽类的降解更新。各类肝病患者因肝细胞损伤,血清LAP的活性均有不同程度的升高,LAP可以作为各类肝病的一项初步检测指标,特别是肝癌鉴别诊断的指标。
LAP分解L-亮氨酸对硝基苯胺生成对硝基苯胺,后者在405nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算LAP活性。
试验中所需的仪器和试剂:
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、丙酮、匀浆器/研钵。
操作步骤:
一、样本处理:
组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL 试剂一)进行冰浴匀浆,然后,10000g,4℃,离心10min。
细胞:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议500 万细胞加入1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3 秒,间隔7 秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
液体:直接检测。
二、测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上,波长调至405nm,分光光度计蒸馏水调零。
2. 加样表:在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入下列试剂
试剂名称( μL)
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测定管
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空白管
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试剂一
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10
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样品上清
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10
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试剂一( μL)
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170
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170
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试剂二( μL)
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20
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20
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在微量玻璃比色皿 /96孔板中分别加入上述试剂,充分混匀后于 405nm处测定 30s时的吸光值A1,迅速置于 37℃水浴 3min(有控温功能的酶标仪可以将温度调至 37℃),拿出迅速擦干测定 210s时的吸光值 A2,计算 △ A空白管 =A2空白 -A1空白, △ A=△A测定管 -△A空白管。空白管只需做一次。
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三、酶活计算公式:
1、按微量玻璃比色皿计算:
(1)血清(浆)LAP 活力的计算:
单位的定义:每mL血清(浆)每分钟生成1nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷V样÷T=675.4×ΔA
(2) 组织、细菌或细胞中LAP 活力的计算:
1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(V样×Cpr) ÷T=675.4×ΔA÷Cpr
2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP(U /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(W× V样÷V样总) ÷T=675.4×ΔA÷W
3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP(U /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.35×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:对硝基苯胺摩尔消光系数,9.87×103 L / mol /cm;109:
1mol=109nmol ;d:比色皿光径,25px;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入试剂一体积,1mL;T:反应时间,3 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
2、按96孔板计算:将上述计算公式中的d-25px 改为d-15px(96孔板光径)进行计算即可。
注意事项:
1、△A大于0.5时或者A值大于1.5时建议将样品上清用试剂一稀释后再进行测定。
2、空白管的△A变化小于0.01。