MK1035-1盒 SABC(山羊IgG)- FITC（POD）kit
产品内容：
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封闭液（5% BSA） |
10mL |
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Bio-兔抗山羊 IgG 浓缩液 |
100μL |
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SABC-FITC浓缩液 |
100μL |
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SABC-POD浓缩液 |
100μL |
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稀释液 |
30mL |
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20×DAB显色液A |
1mL |
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20×DAB显色液B |
1mL |
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抗荧光衰减封片剂 |
10mL |
产品说明：
本试剂盒适合于一抗为山羊 IgG 来源的免疫组化实验. DAB 及 FITC 显色。
SABC 是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。链霉亲和素(StreptAvidin)是一种从链霉菌中提取的蛋白质，同亲和素一样，对生物素有极高的亲和力，亲和素是一个碱性蛋白质（PI=10），经改造后可以转变成中性蛋白质。链霉亲和素等电点接近中性，对组织和细胞的非特异吸附很低，基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。SABC 即 StreptAvidin-Biotin Complex，SABC 大约可形成一百个左右的过氧化物酶或者 FITC 和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物。大量的酶与 FITC 将保证 SABC 具有很高的敏感性。
操作步骤:（以石蜡切片热修复为例）
1. 切片常规脱蜡至水。3%H2O2 室温 5-10 分钟以灭活内源性酶（如果 FITC，可省掉此步）。蒸馏水洗 3 次。
2. 热修复抗原：将切片浸入 0.01M 枸橼酸盐缓冲液（PH6.0），电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔 5-10 分钟后，反复 1-2 次。冷却后 PBS（pH7.2-7.6）洗涤 1-2 次。
3. 滴加 5%BSA 封闭液，室温 20 分钟。甩去多余液体， 免洗。
4. 用稀释液将一抗按一定比例稀释（稀释后的一抗 4℃可保存一周），也可另行购买抗体稀释液。滴加稀释的一抗，37 ℃ 1 小时孵育左右或 20℃ 2 小时左右，也可 4℃过夜。PBS（pH7.2-7.4）洗涤 3 次，每次 2 分钟（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间）。
5. 根据使用量，用稀释液将 bio-兔抗山羊 IgG 浓缩液按 1:100 稀释成工作液(1ml 稀释液加入 10ul bio-兔抗山羊 IgG浓缩液，混匀即成工作液，此工作液 4℃可保存一周)。滴加生物素化兔抗山羊 IgG 工作液，20-37℃ 处理 30 分钟。PBS（pH7.2-7.4）洗涤 3 次，每次 2 分钟。
如果用荧光观察，请接步骤6、7，如果用 DAB 显色，请直接转至步骤 8。
6. 根据使用量，用稀释液将 SABC-FITC 浓缩液按 1:100 稀释成工作液(1ml 稀释液加入10ul SABC-FITC 浓缩液，混匀即成 SABC-FITC 工作液。此工作液 4℃可保存一周)。滴加SABC-FITC 工作液，20-37℃，30 分钟(避光)。PBS（pH7.2-7.4）洗涤 4 次，每次 5 分钟。
7. 滴加抗荧光衰减封片剂封片。荧光显微镜观察。
8. 根据使用量，用稀释液将 SABC-POD 浓缩液按 1:100 稀释成工作液(1ml 稀释液加入 10ul SABC-POD 浓缩液，混匀即成 SABC-POD 工作液。此工作液 4℃可保存一周)。滴加 SABC-POD 工作液，20-37℃，30 分钟。PBS（pH7.2-7.4）洗涤 4 次，每次 5 分钟。
9. DAB 显色：根据用量，用 PBS（pH7.2-7.4）配制，按 1ml PBS 加入 50ul 20×DAB 显色液 A，加入 50ul20×DAB 显色液 B ，混匀后加至切片。室温显色， 镜下控制反应时间，一般在 5-30 分钟之间。蒸馏水洗涤终止反应。
10. 苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。
对于细胞爬片：
常规固定后，PBS 漂洗两次，再用 0.5%Txiton X-100 室温 20 分钟，PBS 漂洗两次，3%H2O2（如果用 FITC，刚可省掉此步）处理 15 分钟；PBS 漂洗两次，下接上面第 4 步。
对于冰冻切片：
固定后，可用 PBS 漂洗两次，再接上面第二步。
注意事项：
如果用 DAB 染色背景过高，在 SABC 反应之后，DAB 显色之前，用加有 0.01-0.02% TWEEN-20 的 PBST（pH7.2-7.4）洗涤切片 4 次，PBS 洗 2 次，然后 DAB 显色。
如果用 FITC 观察背景过高，在 SABC 反应之后，用加有 0.01-0.02% TWEEN-20 的 PBST（pH7.2-7.4）洗涤切片 4 次，PBS 洗涤 2 次，然后封片观察。
因为免疫组化指标众多，标本不一，此步骤仅作参考。
