正常精液是一种混合物,在射精时由睾丸和附睾的分泌物及悬浮其中的精子与前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成,最终射出的混合物是一种粘稠的液体。精子分析的方法有很多,其中可通过培养进行检测。
精子细胞BWW培养基储存液主要由氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、酚红等组成,不含葡萄糖、丙酮酸钠、BSA等以及抗生素,是一种旨在用于广谱动物和人体精子细胞获能处理的常用营养液。
操作步骤(仅供参考):
1、取干净的精液样本室温放置,使之充分液化。
2、制备精子细胞(仅供参考,不是必须步骤):
1)、上泳法:取一个无菌的15ml锥底离心管,加入1ml液化的精液,在其上方轻轻加入1.2ml Earle培养液形成液层,45°倾斜试管,37℃孵育1h。轻轻竖立试管,取出最上层的1ml液体。加入8ml增补的Earle培养液稀释。以 300~500g离心 5分钟,弃上清。加入培养液0.5ml重新悬浮细胞,用于精子密度或功能的评估。
2)、非连续密度梯度法:在试管中制备密度梯度液, 下层为 1ml 80%(v/v)、 上层为 1ml 40%(v/v)的密度梯度液。将 1ml 精液放入密度梯度液上方,以 300~400g离心 15~30分钟。 必要时,每份精液标本可用一个以上的试管。弃去精子沉淀团上的绝大部分上清液。用 5ml 培养液重悬精子沉淀团,轻轻吹打(有助于洗去密度梯度液),然后以200g离心 4~10分钟。弃去精子沉淀团上的绝大部分上清液。用 5ml 培养液重悬精子沉淀团, 轻轻吹打(有助于洗去密度梯度液),然后以200g离心 4~10分钟。用1ml培养液重悬精子沉淀团。
3、将含有精子细胞的离心管置于37℃含5%CO2、95%空气的细胞培养箱中孵育3h。如无上述培养箱,可用含Hepes的缓冲培养液,拧紧管盖,置于37℃的普通培养箱内孵育。在孵育过程中,大多数活动的精子从精浆中游离到覆盖上面的培养液内。
4、离心精子悬液,使精子细胞密度接近于10×106/ml,将精子重悬于0.5ml精子细胞BWW培养基中,并在37℃含5%CO2、95%空气的细胞培养箱内孵育18~24小时。如无上述培养箱,可用含Hepes的缓冲培养液,拧紧管盖,置于37℃的普通培养箱内孵育。在孵育过程中,将试管倾斜与水平面成 45°角。将试管恢复垂直位置 20分钟,使获能后不活动的精子沉降下来。
注意事项:
1、注意无菌操作,尽量避免污染。
2、如无Earle培养液和增补的Earle培养液,可用精子细胞BWW培养基代替。
3、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。