TLDA50 DEAE葡聚糖凝胶A-50

别名 : 17-0180-02

英文名称 : DEAE-Sephadex A-50

储存条件 : 室温

外观(性状) : 颗粒

单位 : 瓶


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  • 商品介绍
  • 规格参数
  • A-50产品简介

    DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH将CL-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为PH6.85-7.5),其余均属酸性蛋白。在PH7.2-7.4的环境中,酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。
    产品参数
    产品名称:DEAE-Sephadex A-50
    基质:Sephadex
    颗粒大小:40-120μm
    最大流速:45cm/h
    工作pH:2-9
    操作温度:室温
    保存条件:室温
    A-50实验步骤
    1、预处理 
    称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5克,悬于500ml蒸馏水,1小时后倾去上层细粒。
    按每克A-50加0.5M NaOH 15ml的比例,将A-50浸泡于0.5M NaOH中,搅匀,静置30分钟,装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至PH呈中性;再以
    0.5M HCl同上操作过程处理,最后以0.5M NaOH再处理一次。处理完后,将A-50浸泡于0.1M,PH 7.4 PB中过夜。
    2、装柱 
    (1)将层析柱垂直固定于滴定铁架上,柱底垫一园尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭
    开关。
    (2)将0.1M,PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入经预处理并以同上缓冲液调
    成稀糊状的A-50。待A-50凝胶沉降2-3cm厚时,启开出水口螺旋夹,控制流速1ml/分钟,同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。
    (3)关闭出水口,待A-50凝胶完全沉降后,柱面放一园形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口,通
    过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
    3、平衡
    启开出水口螺旋夹,控制流速12-14滴/分钟,使约2倍床体积的洗脱液流出。并以PH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH值与离子强度是否相同。达到一致时关闭出水口,停止平衡。
    4、加样及洗脱
    启开上口橡皮塞及下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体与柱面相切时,立即关闭出水口,以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积的2%,蛋白浓度以<100mg为宜)。松开出水口螺旋夹使柱面样品缓慢进入柱内,至与柱面相切时,立即关闭下口,以少量洗脱液洗柱壁2-3次;再放开出水口,使洗液进入床柱,随后立即于柱面上加入数ml洗脱液,紧塞柱上口,使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12~14滴/分钟。
    5、 收集
    开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3~5ml。共收集10~15管。
    6、测蛋白
    以751-G型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm,与OD260nm,按前述
    公式计算各管蛋白含量。并以OD280nm为纵座标,以试管编号为横座标,绘制洗脱曲线。 
    7、合并、浓缩
    将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并,以PEG(MW6000)洗缩至所需体积,加入0.02%NaN3防腐剂,于
    4℃保存备用。
    8、A-50凝胶的再生
    在柱上先以2M NaCl洗柱上的杂蛋白至流出液的OD280nm<0.02,再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达再生。近期用时泡于洗脱缓
    冲液中4℃保存;近期不用时,以无水酒精洗2次,再置50℃温箱烘干,装瓶内保存。
    (四) 注意事项
    1 .柱的选择:从理论上说,只要柱足够长,就得获得理想的分辨率,但由于层析柱流速同
    压力梯度有关,柱长增加使流速减慢,峰变宽,分辨率降低。柱的直径增加,使液体流动的不均匀性增加,分辨率明显下降。
    2. 纯化过程必须严格控制脱缓冲液的PH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲
    液彻底平衡后,才能进行柱层析。
    3.所装的柱床必须表面平整,无沟流及气泡,否则应重装。 
    4.洗脱过程中应严格控制流速,且勿过快。
    5. 上样的体积要小,浓度不宜过高。
    6.加样及整个洗脱过程中,严防柱面变干。


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