细胞培养基础概念

细胞生长 主要是指细胞体积的增大，如：随着个体的不断发育，神经元细胞需要不断的伸长。

细胞繁殖 是通过细胞分裂方式进行的，细胞生长增大，随后又平均地分裂成两个和原来母细胞“一样”的子细胞。

细胞分化 就是由一种相同的细胞类型经过细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程。细胞分化不仅发生在胚胎发育中，而是在一生都进行着，以补充衰老和死亡的细胞，如：多能造血干细

胞分化为不同血细胞的细胞分化过程。 

细胞死亡 是生命现象不可逆停止及生命的结束，正常的组织中经常发生细胞死亡，是维持组织机能和形态所必须的，包括细胞主动死亡-程序性死亡（细胞凋亡）和细胞被动死亡即细胞坏死。

细胞分裂（cell division）是活细胞繁殖其种类的过程。通常包括核分裂和胞质分裂两步。在核分裂过程中母细胞把遗传物质传给子细胞。在单细胞生物中细胞分裂就是个体的繁殖，在多细胞生物中细胞分裂是个体生长、发育和繁殖的基础。

1、无丝分裂（也叫直接分裂）是一种比较简单的分裂方式。在无丝分裂时看不见染色体的复杂变化，核物质直接分裂成二部分。核分裂一般是从核仁开始，延长横裂为二，接着核延长，中间缢缩，分裂成2个核；同时，细胞质也随着拉长并分裂，结果形成2个细胞。这种分裂不如有丝分裂普遍和重要。多见之于某些原生生物，如纤毛虫等。

2、有丝分裂（mitosis）（也叫间接分裂）

   整个有丝分裂过程是连续的，一般把它分为前期、中期、后期和末期。

  特点是有纺锤体染色体出现，子染色体被平均分配到子细胞，这种分裂方式普遍见于高等动植物(动物和高等植物)。是真核细胞分裂产生体细胞的过程。

细胞周期  细胞由一次分裂结束到下一次分裂结束之间的期限称为细胞周期。

间期  又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。

    G1期（first gap）　从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显著增大。这一期的主要意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备。

    S期（synthesis）　即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。

    G2期（second gap）期为DNA合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。

分裂期   M期：细胞分裂期。

       细胞的有丝分裂（mitosis）需经前、中、后，末期，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。

       前期（prophase）染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体（chromosome）。形成纺锤体。

       中期（metaphase）核仁与核被膜消失。染色体移到赤道平面，纺锤体微管附着于染色体着丝点上。

       后期（anaphase）纺锤体微管活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动。

       末期（telophase）染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；分裂为两个2倍体的子细胞。

3、减数分裂（meiosis）

   减数分裂与正常的有丝分裂的不同点在于：减数分裂的具体过程是很复杂的，它包括2次细胞分裂。在减数分裂过程中，细胞分裂2次，但染色体只复制一次，结果染色体数目减少了一半。

  减数分裂对维持物种的染色体数目的恒定性，对遗传物质的分配、重组等都具有重要意义这对生物的进化发展都是极为重要的。

细胞培养(Cell culture)  指从生物机体取出部分组织分散成单个细胞或直接从机体取出单个细胞，也可把体外培养细胞分散成单个细胞在体外条件下培养，细胞能继续存活与增殖。

群体培养（mass culture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；

克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。

原代培养  是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。

原理：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

传代培养 原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。

原代细胞 (Primary cultured cells）是指从生物体（通常指人体器官或组织、小鼠、大鼠、兔子、狗以及家禽等动物）器官和组织，取出后经过蛋白分解酶或者机械方法分离成单个细胞后，加以特殊配方并含有细胞因子、添加剂的培养基而得以生长和繁殖的细胞。原代细胞最大的特点是有限的传代代数，有的原代细胞比如脑运动神经细胞，甚至不能传代， 而有的原代细胞如成纤维细胞可以传代多达14-5代以上，大部分上表皮细胞可以传代7-12代，而内表皮细胞却只能传代4-7代。

原代细胞标准化培养是指根据每一种生物体年龄、器官组织特点以及所需细胞的种类，研发出统一的操作方法和流程，并以试剂盒的形式而统一培养所需原代细胞的各种试剂（组织消毒试剂、蛋白酶、去杂细胞试剂、细胞因子添加剂、血清和基础培养基， 详细说明书）。 这样的话，无论是哪一个实验室，只要是所需要细胞种类一样，其所培养细胞质量就会一致，科研结果就会大致相似。

传代代数这一概念常常容易同“增殖代数”相混淆。细胞“一代”一词仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间。如某一细胞系为第153代，即指该细胞系已传代153次。它与细胞“增殖代数”（细胞世代或倍增）不同，在细胞一代中，细胞约能倍增3～6次。由此可见，细胞代数与增殖代数相关，确切的代数则依赖于细胞株和培养条件的不同而异。但构成一个细胞系的生长条件必须是同样的，因而细胞系应该表达近似的增殖代数或倍增代数。

一般来讲，原代取材养出来的细胞经过首次传代以后便改称细胞系（cell line）。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系。

用一定方法（如克隆法）从原代细胞或者细胞系筛选出一个或者一群具有某些特征或标记（如稳定的染色体组型，同工酶，生化特性，等）的细胞并在其子代中保持稳定不变者称为细胞株（cell strain），再次克隆形成的细胞群体称亚株（sub strain）。

贴壁培养  是指大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上才能正常生长，并最终在附着表面扩展成单层。其基本操作过程是：先将采集到的活体动物组织在无菌条件下采用物理(机械分散法)或化学(酶消化法)的方法分散成细胞悬液，经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加 有适宜培养液的培养皿(瓶、板)中，再放入二氧化碳培养箱进行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察，适于实验室研究。但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性，一旦细胞形成单层，生长就会受到抑制，细胞产量有限。如要继续培养，还需将已形成单层的细胞再分散，稀释后重新接种，然后进行传代培养。

贴壁效率（％）＝(每孔克隆平均数/ 每孔活存的培养细胞平均数) X100％

相对贴壁效率＝被测血清贴壁效率/参考血清贴壁效率

悬浮培养 是指少数悬浮生长型动物细胞在离体培养时不需要附着物，悬浮于培养液中即可良好生长。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。培养时只需将采集 到的活体动物组织经分散、过滤、纯化、漂洗后，按一定密度接种于适宜培养液中，置于特定的培养条件下即可良好生长。传代时不需要再分散，只需按比例稀释后 即可继续培养。此法细胞增殖快，产量高，培养过程简单，是大规模培养动物细胞的理想模式。但在动物体中只有少数种类的细胞适于悬浮培养。

贴壁生长的细胞

活体体内的细胞当离体置于体外培养时大多数均以贴壁方式生长，主要包括正常细胞和肿瘤细胞，比如成纤维细胞，骨骼组织（骨及软骨），心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤神经胶质细胞，内分泌细胞，黑色素细胞及各种肿瘤细胞等。

大致分成以下四型：

1、成纤维细胞型：

  名称：凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。

  形态：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突  起，生长时呈放射状或旋涡状

  来源：成纤维细胞，心肌、平滑肌、

成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。

2、上皮型细胞：

  名称：仅形态上似上皮细胞的多种培养细胞

  形态：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。

  来源：皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。

3、游走细胞型：

   呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。

4、多型细胞型：

  有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。

悬浮型细胞 

来源：来自于血，脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液中白细胞以及癌肿细胞等

特点：胞体圆形，不贴于支持物上，在悬浮中生长良好细胞成圆形，单个或小细胞团，这类细胞容易大量繁殖。

优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态

缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)

细胞转染  是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。